在單分子水平研究生物分子相互作用的分子機(jī)制，對(duì)于深入了解生物分子的特異識(shí)別、生化過程以及分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要意義，是目前生物、化學(xué)、物理交叉領(lǐng)域的一個(gè)前沿方向。原子力顯微鏡單分子力譜法以其獨(dú)特的優(yōu)越性在生物單分子相互作用的研究中發(fā)揮著十分重要的作用。原子力顯微鏡(atomicforcemicroscopy，AFM)是1986年由美國IBM公司的Binnig和Stanford大學(xué)的Quate等發(fā)明的。由于AFM具有原子級(jí)的高空間分辨率(橫向分辨率可達(dá)0.1nm，縱向分辨率可達(dá)0.01nm)，制樣方法簡(jiǎn)單，能在接近生理環(huán)境的條件下(如溶液中)操作，利用它對(duì)生物樣品進(jìn)行高分辨成像，已成為生物學(xué)研究的常用技術(shù)，廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等各領(lǐng)域。Lee等報(bào)道利用AFM皮牛級(jí)的測(cè)力靈敏度來研究生物分子間的非共價(jià)作用(一般認(rèn)為單對(duì)生物分子間的非共價(jià)作用力為幾十到幾百皮牛)，使得傳統(tǒng)熱力學(xué)研究方法無法實(shí)現(xiàn)的單分子水平上分子間相互作用力的測(cè)定成為可能。此后，用于研究生物分子相互作用的原子力顯微鏡單分子力譜法(singlemoleculeforcespectroscopy)迅速發(fā)展起來。

最早利用AFM單分子力譜研究的是鏈霉親和素/生物素及親和素/生物素體系，它們被認(rèn)為是最強(qiáng)的非共價(jià)結(jié)合分子對(duì)，其離解常數(shù)達(dá)到10-15mol/L。Lee等用生物素修飾的AFM針尖與鏈霉親和素修飾的云母測(cè)定了單對(duì)鏈霉親和素/生物素相互作用力，發(fā)現(xiàn)其大小比用鏈霉親和素溶液封阻后的針尖-基底非特異作用力大3－8倍，證實(shí)了單分子力譜研究單對(duì)生物分子相互作用的可行性。隨后人們應(yīng)用AFM單分子力譜研究了大量生物分子配體/受體的結(jié)合，下面僅舉幾例介紹近年來單分子力譜在研究蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/DNA相互作用，及蛋白質(zhì)去折疊等方面的應(yīng)用進(jìn)展。蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)的相互作用單分子力譜法建立后便廣泛用于表征抗體/抗原分子的親合力。

Hinterdorfer等研究了白蛋白抗體與抗原的相互作用力，并改進(jìn)了蛋白質(zhì)的固定方法，通過一段PEG高分子聚合物鏈將蛋白質(zhì)與表面相連，這樣不僅增加了抗體抗原的空間自由度，而且能從力-距離曲線圖上將其特異性相互作用與針尖和基底的非特異性相互作用力區(qū)分開來，成為目前固定蛋白質(zhì)的常用方法。他們進(jìn)一步用修飾了抗體的針尖對(duì)抗原樣品掃描，發(fā)展了將AFM測(cè)力模式和掃描成像相結(jié)合的識(shí)別成像技術(shù)。采用交變磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)表面被磁化的AFM微懸臂，可同時(shí)得到成像點(diǎn)的圖像信息與分子間相互作用力，即同時(shí)獲得高分辨的形貌像和識(shí)別像，克服了AFM成像只能給出分子的形狀和大小信息的局限，使得AFM對(duì)成像分子的種類和成份具備一定的識(shí)別能力?？贵w與抗原的相互作用在免疫反應(yīng)的研究中有重要價(jià)值。

Kim等研究了抗微生物肽對(duì)脂多糖(LPS)和免疫蛋白(脂多糖結(jié)合蛋白LBP和CD14)間相互作用的影響。脂多糖結(jié)合蛋白LBP和受體蛋白CD14同LPS的結(jié)合可觸發(fā)敗血癥性休克引發(fā)的免疫響應(yīng)，但具體機(jī)制仍不清楚。測(cè)定針尖上固定的LBP蛋白和基底上脂雙層生物膜中CD14的相互作用力，發(fā)現(xiàn)LPS存在下形成LPS-LBP復(fù)合物后與CD14間的結(jié)合力明顯高于LBP和CD14間的結(jié)合力，且LPS的糖鏈區(qū)越長，結(jié)合力越大，說明LPS尤其是其糖鏈區(qū)在LBP與CD14的結(jié)合上起著重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗微生物肽多粘霉素B能特異性地抑制LBPLPS和CD14的結(jié)合。蛋白質(zhì)/DNA的相互作用　通常利用AFM成像可觀測(cè)蛋白質(zhì)/DNA的結(jié)合。我們研究組較早報(bào)導(dǎo)了用AFM單分子力譜定量地表征蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合力，如發(fā)現(xiàn)新型蛋白探針aptamer與蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)于抗體/抗原等。最近，Krasnoslobodtsev等[30]研究了DNA限制性內(nèi)切酶SfiI與雙鏈DNA復(fù)合物的單分子力譜，推測(cè)SfiI與雙鏈DNA結(jié)合形成能瞬間分離的動(dòng)態(tài)復(fù)合物。SfiI特異識(shí)別的DNA序列中有一段間隔序列，它不與SfiI結(jié)合，但其序列的改變卻能改變蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物的解離速度，從而影響SfiI酶的切割速度。了解轉(zhuǎn)錄因子與其DNA元件的相互作用是研究基因表達(dá)和調(diào)控的基礎(chǔ)。我們研究組建立了利用單分子力譜研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動(dòng)子相互作用的方法，并應(yīng)用于檢測(cè)多種新發(fā)現(xiàn)的植物轉(zhuǎn)錄因子與其DNA元件DRE和ERE的結(jié)合，結(jié)果表明AFM在測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子與其DNA啟動(dòng)子作用力方面具有很高的靈敏度：轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域中單個(gè)關(guān)鍵氨基酸的突變或者啟動(dòng)子核心序列中單個(gè)堿基被其他堿基取代，都使得兩者的結(jié)合力和結(jié)合幾率大大減弱。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步研究了單分子作用力大小與轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能的聯(lián)系，如研究水稻TINY蛋白及兩種單氨基酸突變的突變體與DRE元件的相互作用力，AFM單分子力譜的結(jié)果表明其中一種突變體不與DRE結(jié)合，另一種能與DRE結(jié)合，但結(jié)合力小于野生型TINY。同時(shí)，用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TINY及兩種突變體的基因激活活性，結(jié)果顯示結(jié)合力越強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子激活下游基因的表達(dá)越高。因此，單分子力譜測(cè)得的作用力大小可與其基因調(diào)控水平相關(guān)聯(lián)。與生物學(xué)研究中通常采用的凝膠電泳等方法相比，AFM具有耗樣量少、制樣簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)越性，有望成為表征轉(zhuǎn)錄因子、確定其DNA響應(yīng)元件和進(jìn)行功能基因組研究的新工具。

蛋白質(zhì)的去折疊AFM單分子力譜也可用于分子內(nèi)相互作用的研究，如將蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的兩端分別固定于AFM針尖和基底，進(jìn)行“單分子拉伸實(shí)驗(yàn)”，研究這些生物大分子的機(jī)械性質(zhì)和折疊/去折疊過程。許多功能蛋白依靠分子內(nèi)的各種相互作用維持其穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)溶液中具有一定構(gòu)象的蛋白質(zhì)進(jìn)行拉伸，可以得到蛋白質(zhì)解折疊的勢(shì)能圖，分析蛋白質(zhì)去折疊過程中的構(gòu)象變化。

通過對(duì)單個(gè)纖維蛋白原的拉伸從微觀角度分析血凝塊機(jī)械性質(zhì)的分子機(jī)理。纖維蛋白原是血凝塊中主要成份纖連蛋白的前體，激活后組裝成纖連蛋白纖維，形成具有一定彈性的血凝塊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以起到止血作用。用AFM拉伸線性的纖維蛋白原寡聚物，得到鋸齒狀的去折疊力曲線，表明纖維蛋白原的三鏈卷曲螺旋結(jié)構(gòu)中每個(gè)卷曲螺旋獨(dú)立地去折疊。與肌球蛋白的雙鏈卷曲螺旋不同，后者在去折疊后可快速重新折疊，而纖維蛋白原三鏈卷曲螺旋去折疊后的重新折疊可忽略不計(jì)，這種區(qū)別是由纖維蛋白原的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和蛋白本身的結(jié)構(gòu)決定的 。