1982年，IBM公司蘇黎世實驗室的Binning等人發(fā)明了世界上第一臺掃描隧道顯微鏡(簡稱STM)，從而可在原子級分辨率水平上測量材料的表面形貌，為人類探索超微觀世界的奧秘提供了有力的觀察和研究工具，由此發(fā)明者獲得了1986年的諾貝爾物理獎。隨著STM在表面科學和生命科學等領域中的廣泛應用，相繼出現(xiàn)了許多同STM技術相似的新型掃描探針顯微鏡(SPM)，主要有掃描力顯微鏡(SFM)、彈道電子發(fā)射顯微鏡(BEEM)、掃描離子電導顯微鏡(SICM)、掃描近場光學顯微鏡(SN-OM)等，它們都可以在極高分辨率條件下研究不同材料的表面或界面結構。其中，Binning等人于1986年發(fā)明的原子力顯微鏡(atomicforcemi-croscopy，簡稱AFM)是最具代表性的掃描力顯微鏡，也是SPM家族中應用最廣泛的表面觀察研究工具之一。

AFM不僅能在原子尺度上對導體、半導體表面進行成像，而且能獲得諸如玻璃、陶瓷等非導電材料的表面結構，并能夠根據(jù)研究材料的不同需要，在真空、大氣或水中實時地直接觀察物體;不僅可得到樣品的三維形貌圖像，也可以對材料表面進行粒度、厚度、粗糙度等計算統(tǒng)計;不僅可以探測分子間的作用力，而且可對材料實現(xiàn)納米操縱。與掃描電鏡(SEM)相比，AFM縱向分辨率高，克服了必須在真空條件下測試的限制，而且檢測非導電材料不需要噴金處理，更適用于生物材料研究;而與透射電鏡(TEM)相比，AFM對樣品損害小。因此，盡管AFM問世時間較短，其應用理論與技術迅猛發(fā)展，在高分子材料科學、生命科學以及表面科學等領域中廣泛應用。

近年來，AFM技術也受到皮革領域研究工作者的關注，在研究膠原形態(tài)結構、鞣制機理、環(huán)境因素誘導的膠原聚集、皮化材料等方面，已有一些文獻報道。本文首先簡介原子力顯微鏡的工作原理和成像模式，著重對其在皮革學科領域中的應用情況進行回顧和評論。

AFM的基本原理與光學顯微鏡和電子顯微鏡不同，AFM不是采用光學或電子透鏡來成像，而是利用尖銳探針在樣品表面上方掃描來檢測樣品的一些性質。

將對微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的尖銳探針，當探針與被測樣品接近時，探針與樣品間發(fā)生原子間的相互作用力，這一作用力導致微懸臂發(fā)生彈性形變，光電檢測系統(tǒng)可通過微懸臂背面反射的激光束的位移檢測到這一變化。在AFM經(jīng)常使用的恒力模式下，反饋系統(tǒng)根據(jù)檢測器電壓的變化，不斷通過壓電陶瓷調整針尖或樣品的Z軸方向的位置，保持針尖—樣品間作用力恒定不變，針尖和樣品所被調整的Z軸距離作為Z方向的信號，再加上表征樣品被掃描位置的X、Y方向信號，即可得到樣品的表面形貌。AFM的圖像也可以使用“恒高”模式來獲得，也就是在X、Y掃描過程中，保持針尖與樣品之間的距離恒定，通過測量微懸臂Z方向的形變量來成像。這種方式不使用反饋回路，可以采用更高的掃描速度，通常在觀察原子、分子像時用得比較多，而不適用于表面起伏比較大的樣品。根據(jù)所研究樣品表面結構性質及研究需要的不同，相應的還可以選用其它操作模式，如恒梯度模式、譜學模式等，利用譜學模式可以測得力—距離曲線，從而測量探針與材料表面的各種相互作用力，得到表面定域粘彈性質的信息。

AFM的成像模式根據(jù)探針同樣品間距離及作用力性質的不同，AFM主要有3種成像模式:接觸模式、非接觸模式、輕敲模式或稱動態(tài)模式。

在接觸模式中，針尖與樣品間距離小于0．03nm，原子間力為排斥力，其大小為10－8～10－11N，可認為針尖始終和樣品接觸，在樣品表面簡單移動，以恒高或恒力等模式進行掃描。接觸模式通?？梢援a(chǎn)生穩(wěn)定的、高分辨率的圖像，但是由于針尖在樣品表面上滑動及樣品表面與針尖的粘附力、毛細作用等，可能使針尖受到損害、樣品變形，得到假象，所以接觸模式一般不適用于研究生物大分子、低彈性模量樣品以及容易移動變形的樣品。

在非接觸模式中，針尖在樣品表面上方振動，探針距離樣品表面上方5～20nm，始終不與樣品接觸，探針監(jiān)測器檢測的是范德華吸引力和靜電力等長程作用力。這種模式雖然增加了顯微鏡的靈敏度，但由于針尖與樣品間距較長，分辨率比接觸模式和輕敲模式都低，成像不穩(wěn)定，操作相對困難，通常不適用于在液體中成像，在生物中的應用也較少。

輕敲模式是介于接觸模式和非接觸模式之間的成像技術，微懸臂在其共振頻率附近作受迫振動，輕輕地敲擊樣品表面，間斷地和樣品接觸，針尖與樣品間的作用力通常為10－9～10－12N。由于針尖與樣品接觸，分辨率幾乎同接觸模式一樣，同時由于接觸短暫，可提供針尖足夠的振幅來克服針尖和樣品間的粘附力，避免針尖粘附到樣品上;另外由于作用力是垂直的，表面材料受橫向摩擦力和剪切力影響較小。不過，這一垂直力也會使柔軟或有彈性的樣品表面發(fā)生變形，所以輕敲模式圖象經(jīng)常反映的是樣品表面形貌與彈性特性的混合。輕敲模式在大氣和液體環(huán)境下都可以實現(xiàn):在液體中，由于液體的阻尼作用，針尖與樣品的剪切力更小，對樣品的損傷也更小，所以可以對活性生物樣品進行現(xiàn)場檢測、對溶液反應進行現(xiàn)場跟蹤等。輕敲模式在高分子聚合物和生物樣品的研究中應用較多。

輕敲模式的另一重要應用是相位成像(phaseimaging)，即通過測定掃描過程中微懸臂的振蕩相位和壓電陶瓷驅動信號的振蕩相位之間的差值，來研究材料表面的不同性質。相位成像技術可以用來研究樣品的表面摩擦、材料的粘彈性和粘附性等，也可以對表面的不同組分進行化學識別，比如它對于識別表面污染物、復合材料中的不同組分以及表面粘性或硬度不同的區(qū)域非常有效。它所得信息與橫向力顯微鏡相近，但因為采用了輕敲模式，可以適用于柔軟易損、粘附性強或與基底結合不牢的樣品。

對于一定的試驗體系，即使是輕敲模式，吸附顆粒也可能粘附到探針上，造成雙針尖假象。在實際操作中，通常根據(jù)被測材料的特性以及不同的研究需要，選擇合適的操作模式與成像模式。例如對柔軟的膠原纖維的成像多采用輕敲模式，因為輕敲模式所用的力比接觸模式低，并且摩擦力更小。

AFM在膠原形態(tài)結構研究中的應用

作為制革原料的動物皮是一種復雜的生物組織，其特有的纖維編織結構是皮革物理機械性能的基礎，制革工藝過程中的化學、機械和生物作用，就是通過適度改變其組織結構并由此決定成革的性能和質量。動物皮中含量最高的成分是膠原，膠原纖維具有多級結構，膠原最基本單位是膠原分子，是由3條左旋α肽鏈構成的右手螺旋分子，直徑1．5nm，長約280nm，5個膠原分子按照四分之一錯列排列，并通過首尾重疊部位相互交聯(lián)形成微原纖維，直徑約為8nm，微原纖維進一步形成直徑為30nm到500nm不等的原纖維，原纖維排列形成基礎纖維和纖維束。AFM使得人們可以直觀觀察到膠原的細微結構。根據(jù)制樣方法的不同，我們這里把樣品分為2類，原生膠原纖維和再生膠原纖維，前者是指從動物體上取下的組織，經(jīng)過去肉、脫脂等步驟，直接用于AFM觀測，后者是指經(jīng)過酸法、堿法或酶法分離提取出的膠原溶液，再經(jīng)過一系列的處理制得的樣品。

Revenko等用AFM觀測了原生的鼠尾跟腱膠原纖維和再生的鼠尾跟腱膠原纖維，并與TEM、SEM測試結果比較。他們采用輕敲模式觀測到的原生膠原纖維寬度約為200nm，D周期為69nm，明暗帶之間高度差為16nm;重組的膠原纖維寬約90～130nm，D周期67nm，明暗帶間高度差為4nm。與電鏡結果比較，AFM的橫向分辨率(XY方向)接近SEM，不如TEM，但是AFM具有Z方向分辨率高的優(yōu)勢，能夠獲得明暗周期高度差。Baselt等用AFM研究了原生鼠尾膠原纖維和再生牛皮膠原纖維的形態(tài)，得到類似的結果，原纖維D周期為60～70nm，明暗帶間的高度差隨原纖維的粗細由5到15nm不等，與TEM的結果相似，還發(fā)現(xiàn)在明帶中有1nm深的小暗帶;當將膠原纖維浸入水中測試時，D周期等結構不再明顯。

利用AFM可以觀察膠原纖維的順序自組裝過程。Gale等先制備了膠原溶液，然后在不同的時間間隔取樣于AFM下檢測，觀察到牛皮膠原從膠原分子(直徑1～2nm，長300～500nm)到微原纖維(直徑2～6nm、長大于10μm，D周期約67nm)，再到原纖維(D周期約67nm)的順序自組裝過程。Cisneros等用AFM追蹤了牛皮膠原的自組裝，提出膠原分子間先相互聚集成低聚物，然后重新排列組裝成微原纖維的推論。

AFM不僅可以觀測膠原纖維表面形貌，而且可以對膠原進行納米解剖，觀測膠原纖維內部結構形貌，進一步測試膠原的一些性能。Wen等在獲得FLS(長間距片段)型膠原纖維的表面形貌之后，利用AFM實現(xiàn)了對單根膠原纖維的納米解剖，對內部結構直接成像。Strasser等不僅通過顯微解剖對牛皮膠原內部結構清晰成像，并且利用AFM記錄力—距離曲線，對膠原纖維外部和內部的彈性性能進行了測試。其結果顯示:牛皮膠原原纖維高度為30nm，寬度為270nm，呈現(xiàn)清晰的明暗交替周期約78nm的條紋，解剖的深度約為原纖維高度的一半，纖維內部與外部的條紋結構相吻合，周期一致，彈性測試結果表明，原纖維內部與外部的楊氏模量相同，但是內部的黏度高于外部。

鑒于AFM可以在納米尺度直接觀察膠原的形態(tài)結構，所以近年也用于對提取膠原的形貌結構表征和鑒定，如:劉蘇銳等用酶法提取豬皮膠原，在AFM下觀察其為300nm長、15nm寬的纖維，由此推斷提取的豬皮Ⅰ型膠原結構未破壞。我們課題組采用酶法提取的牛跟腱I型膠原的AFM圖像，可以看到膠原細纖維(Φ10～30nm)在云母表面鋪展排布較均勻。