苯甲酸鈉(Sodiumbenzoate,SB)又稱安息香酸鈉,是廣泛應用于食品及碳酸飲料產(chǎn)業(yè)中的防腐劑。多年來世界上大多數(shù)國家一直允許用SB作為食品防腐劑,最大允許量在0.15~0.25wt%之間,在美國,SB的最大允許量為0.1wt%。

隨著食品工業(yè)的發(fā)展,食品中使用防腐劑的現(xiàn)象十分普遍。過去曾認為SB對人體無毒,但最近的研究表明,其可造成人體組織器官或機能的損害,具有遺傳毒性,使染色體分裂出現(xiàn)異常,使染色體發(fā)生結構畸變以致斷裂[并且會產(chǎn)生肝硬化、肌肉損傷甚至致癌,Tsay等發(fā)現(xiàn)SB能使斑馬幼蟲發(fā)生畸變。長期飲用含有SB的碳酸飲料易使兒童產(chǎn)生多動癥。因此,胡明鉛等:應用原子力顯微鏡分析苯甲酸鈉生物毒性1429Journals.im.ac.cnSB的生物安全性和對人體的危害程度必然要引起我們的重視。

原子力顯微鏡(Atomicforcemicroscope,AFM)是1986年由G.Binning,C.F.Quate和C.Gerber等發(fā)明的。自發(fā)明以來它就被廣泛應用于對單細胞、細胞骨架、DNA、蛋白質(zhì)等生物樣品及其相互作用力的研究。目前在單細胞水平上研究SB致淋巴細胞形態(tài)及其膜超微結構損傷的影響尚未見報道。

本研究利用AFM在單細胞水平提供有關SB毒性的可視化證據(jù),并探討其損傷機制。經(jīng)AFM掃描成像,獲得了正常淋巴細胞、與不同濃度SB作用不同時間后的淋巴細胞的拓撲形貌圖(Topography)和誤差信號圖(Errorsignal),并分別對其表面超微結構進行了掃描分析,觀察細胞數(shù)超過30個。

檢測結果發(fā)現(xiàn),上述3種淋巴細胞均呈不同程度的形態(tài)結構改變。正常淋巴細胞呈較為規(guī)則的圓形,中間隆起,細胞表面總體較為平滑,高度在1.8~2.5μm之間,直徑約為8~10μm。而與不同濃度SB作用后的淋巴細胞體積明顯發(fā)生變化。高度減少,細胞表面形態(tài)結構更為復雜,中間部位出現(xiàn)明顯破裂并且凹陷,呈“Y”型結構,邊緣能觀察到有細微損傷分布并且隨著SB濃度的增加,細胞形態(tài)進一步發(fā)生改變,呈中間凹陷狀,細胞邊緣向四周扁平鋪展。細胞表面球狀顆粒進一步增多,表面粗糙度增大,細胞高度明顯減少,直徑增加。對其局部小范圍進行觀察,AFM能清楚地觀察到細胞膜密集的顆粒狀突起物以及大量的孔洞,其中凹凸不平的細胞表面分布著大量小顆粒。

選取不同細胞膜超微結構圖的整個區(qū)域(5μm×5μm)進行測量,與SB作用后淋巴細胞的四個參數(shù)值均明顯與正常淋巴細胞不同;對淋巴細胞膜形成的大小不一的顆粒進行統(tǒng)計,經(jīng)SB作用后的淋巴細胞膜形成的顆粒逐漸增大。同時,隨著與SB作用時間的延長,淋巴細胞出現(xiàn)的變化與上述情況類似,即作用時間越長,細胞損傷越嚴重,淋巴細胞的表面粗糙度也逐漸增加。3討論AFM是樣品表面信息的收集工具,較易獲得細胞的形貌、超微結構及其生化反應后細胞形態(tài)變化等信息,是研究細胞損傷的有力工具。淋巴細胞是機體免疫應答功能的重要細胞成分,其形態(tài)結構與其功能息息相關。

因此利用原子力顯微鏡AFM研究淋巴細胞與外界環(huán)境相互作用前后細胞形態(tài)結構及其細胞膜的變化,對了解淋巴細胞的生理功能具有十分重要的意義。